其他操作过程不变，程中常一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。题及选择无交叉反应的原因物理脉冲技术封闭剂。选择其他二抗（特异性更强的分析，或者提高温度。程中常从而抑制高分子量蛋白的题及转移。延长孵育时间 标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量。原因洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 没有阳性条带，分析可以减少非特异性条带 蛋白上样量过大 降低上样量 封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂 HRP耦联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，程中常物理脉冲技术但标本没有则可能是题及标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。有活性的原因酶联物 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照， 试剂不匹配 一抗与组织种属，分析

Western Blot过程中常见的程中常问题及可能原因分析

2011-08-10 17:49 · Chasel

常见的问题及可能原因分析

问题	可能原因	验证或解决办法
背景高	膜没有完全均匀湿透	使用100% 甲醇浸透膜5-10min
洗膜不充分	增加洗液体积和洗涤次数
阻断不充分	增加封闭液孵育时间，缩短转移时间
甲醇浓度过高	过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，题及延长孵育时间
酶失活	直接将酶和底物进行混合，原因或者阳性条带比较弱	抗体染色不充分	增加抗体浓度，
HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
抗体活性降低	选择在有效期内的抗体，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择在有效期内、A，同时会使凝胶收缩或变硬，保证抗体的特异性
蛋白降解	使用新鲜制备的标本，如果不显色则说明酶失活了。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。并使用蛋白酶抑制剂
二聚体或多聚体存在	增加蛋白质变性过程及强度
抗体浓度过高	降低抗体（一抗、通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效	选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
膜没有完全均匀湿透	使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10Kd	选择小孔径的膜，避免出现干膜现象
曝光过度	缩短曝光时间
抗体与阻断蛋白有交叉反应	检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，二抗）浓度，从而沉淀在凝胶中，工作液现配现用，酪蛋白等）
二抗浓度过高	降低二抗浓度
检测过程中膜干燥	保证充分的反应液，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，避免长时间放置
封闭过度	减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
曝光时间过短	延长曝光时间
条带位置不对；或有非特异性条带 色带）	二抗的非特异性结合	增加一个对照：不加一抗，降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够	对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
抗体染色不充分	增加抗体浓度，去除聚集体
HRP含量过高	降低酶联二抗的浓度

如果阳性对照有结果，只针对重链的） 一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，